众所周知，大自然是许多研究，发现和实验的绝佳灵感来源。鸟类和有翼昆虫向我们展示了天空是可以实现的，水生哺乳动物向我们展示了如何延长我们在水下的停留时间，而蜘蛛也证明了即使最小的生物也可以创造出令人难以置信的东西。在我们今天正在考虑的研究中，来自日本和光的物理和化学研究所的科学家找到了一种利用光养细菌创建人造网的方法。他们到底是如何实现的，所产生的蜘蛛网有多自然？为什么使用光养细菌？这些和其他问题的答案在科学家的报告中等待着我们。走。
研究依据
对许多人来说，蜘蛛是“哦，上帝，把他从我身上救出来！”或“啊，真恶心”。但是，撇开对这些生物的恐惧和偏见，人们可以考虑这些八足的捕食者的独特性。蜘蛛解剖学是为了完美狩猎而制作的。一方面，有毒药可能使瘫痪或杀死猎物或敌人。另一方面，感觉器官发达（尤其是由于全身的毛癣菌（头发）引起的触觉）。蜘蛛的名片就是它们的网络，它已成为许多隐喻和流行语的基础。
有关蜘蛛如何产生其著名的网的视频。
网的核心是蛋白质，其成分富含甘氨酸（C 2 H 5 NO 2），丙氨酸（NH 2 -CH（CH 3）-COOH）和丝氨酸（HO 2 C-CH（NH 2）CH 2 OH） ）。蜘蛛网形成于特殊的腺体中，呈液态。
当腺体的分泌物通过许多旋转的管子被分泌出来时，特殊的蜘蛛疣会从中形成丝线，蜘蛛会用它来建立致命的陷阱。
蜘蛛网线的独特之处在于其机械性能优于许多其他材料。例如，对于普通蜘蛛（Araneus diadematus），蜘蛛网的拉伸强度为1.1-2.7 GPa，对于人的毛发为0.25 GPa，对于钢为0.4-1.5 GPa。蜘蛛丝的密度是钢的密度的1/6（1.3 g / cm 3）。也就是说，如果您用网绕地球，那么它的重量将仅为500克。能量密度约为1.2×108 J / m 3... 蜘蛛丝也非常柔软，即 可以拉伸至其原始长度的5倍（处于松弛状态）而不会中断。蜘蛛网的冲击强度与聚芳酰胺纱线相当。蜘蛛不是极端的，但它们的网很容易在-40°C至220°C的温度下生存。此外，丝绸的可生物降解和生物相容性使其适合医疗应用。
钢丝和蜘蛛丝抗拉强度的比较（相应的密度）。
还奇怪的是，一种蜘蛛可以产生几种类型的网，这些网的性质和用途不同（Argiope argentata物种的蜘蛛可以产生多达5种网的变体）：
- 用于外部边缘和腹板框架（非常耐用）；
- 用于捕获猎物的区域（非常粘，有弹性和耐用）；
- ( );
- ( 2 3 );
- ;
- .
这只是蜘蛛丝的简短描述，但即使如此，也足以理解该物质的独特性。这就是为什么许多科学家长期以来一直在尝试创建与之类似的人造网络的原因。对于许多人来说，这是相当成功的。但是，大规模生产的问题仍未解决。
在我们今天正在考虑的工作中，科学家们提出了解决该问题的方案。它包括使用紫色细菌Rhodovulum sulfidophilum，它具有光营养盐*和嗜盐菌*的特性。
光养生物*是利用光产生能量的生物。
嗜盐菌*是生活在高盐度条件下的一种极端微生物。Sulfidophilum是一种海洋产的光合细菌，具有不同的代谢特征，可产生生物氢，生物塑料和细胞外核酸。
产氧光合作用* -与普通光合作用不同，产氧光合作用过程中不会形成分子氧。但是，对于科学家来说，硫辛假单胞菌最重要的技能是通过光合作用和固定过程，通过使用廉价的可再生资源（例如光（能量），CO 2（碳源）和N 2（氮源）），在光养养条件下生长的能力。氮。此外，硫杆菌在海水中壮成长，这有助于降低养殖过程中受到生物污染的风险。
近年来，在使用重组宿主生物（大肠杆菌细菌，巴斯德毕赤酵母，蚕）的大规模生产spidroin（MaSp，蜘蛛丝蛋白）方面取得了良好的结果。家蚕，烟草，哺乳动物细胞培养等）。
这项工作的作者并没有否认其前任的成功，但注意到由于生产本身的高昂成本（在微生物发酵的情况下，70％的生产成本是原材料），其生产量极小且最终产品的成本较高。
在他们的研究中，作者提出了一种使用细菌R.sulfidophilum经济高效地生产蜘蛛丝的新方法，该细菌能够在光异养或光自养生长条件下使用少量有机物产生疏水重复序列MaSp1（spidroin-1）。
研究成果
首先，有必要准备细菌R.sulfidophilum。
以前已经报道了利用从pCF1010和大肠杆菌S17-1获得的质粒通过细菌结合将外源质粒DNA引入硫糖杆菌的可能性。
结合* -两个细菌细胞直接接触过程中一部分遗传物质的单向转移。在这项研究中，决定使用另一种包含卡那霉素抗性基因，编码特定核酸酶的mob基因和转移源（oriT *）的载体（pBBR1MCS-2 ），它们被广泛用于革兰氏阴性细菌缀合。
oriT *是在细菌结合过程中，将包含它的DNA从细菌宿主转移到受体所必需的短序列（最高500 bp）。在硫糖嗜热杆菌的染色体（登录号NZ_CP015418）中，在A6W98_RS06280和A6W98_RS17070位点存在两个编码TerB家族的亚碲酸盐抗性蛋白的亚碲酸盐抗性基因。
抗卡那霉素和碲酸盐的性状被用作选择嗜R. sulfidophilum阳性结合物的标志。
质粒* pBBR1-Ptrc-MaSp1包含：
- * trc启动子（Ptrc），是大肠杆菌中一种有效的杂种组成型启动子；
- 核糖体结合区（RBS）的序列“ AGGAGA”；
- MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).
* — , .
* — , - ( ).约为0.4克湿细胞量（CWM从细胞湿重）从50毫升的重组培养物获得R. sulfidophilum光能异养生条件，即从海肉汤（MB从下生长至稳定生长海洋肉汤）与LED照明在（730 nm，20-30 W / m 2）4天。
图像＃1
尽管重组MASP1蛋白的过表达不是在所有的重组培养物中清楚地检测到R. sulfidophilum使用聚丙烯酰胺凝胶电泳/ SDS-PAGE（1C），通过对所有创建的带有pBBR1-Ptrc-MaSp1-（1-mer，2-mer，3-mer或6-mer）pBBR1-Ptrc-MaSp1-（1d）的重组R.sulfidophilum细胞进行蛋白免疫印迹确认了MaSp1蛋白的阳性表达。
K度量* -生物序列中包含的长度k的子序列。所得构建体中的唯一重复结构域含有以下形式的33个氨基酸残基：
NH 2 -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH。
目标蛋白的理论分子量（包括非sidroin序列（His-Tag，S-Tag，肠激酶和凝血酶的切割区域））在1端（81个氨基酸）的N端为7.9 kDa；2个单体（114aa）时为10.5 kDa；3聚体（147 aa）为13.1 kDa，6聚体（246 aa）为20.9 kDa。
是-原子质量单位的指定；kDa-千道尔顿（1 kDa = 103 Da）。除了确认MaSp1蛋白的表达外，还估计了从硫枯菌的重组培养物中获得的MaSp1蛋白的量：〜3-10 mg / L（1-mer = 3.4 mg / L； 2-mer = 3.9 mg / L ； 3-mer = 10.2 mg / l； 6-mer = 6.8 mg / l）或蛋白质总量的3.5–6.9％。为了进行比较，在众所周知的和广泛使用的大肠杆菌重组系统中，spidroins的异源表达仅能产生约0.3–1.2 mg / L的纯化spidroin。
显性等位基因用大写字母表示（A对a）。由于每个亲本都提供一个等位基因，因此可以进行以下组合：AA，AA和aa。
根据科学家的说法，最令人惊讶的结果是该研究证明了基于海洋光合生物的微生物细胞工厂，其中可以使用可再生的非食品原料和海水作为培养基来应用光合自养生长机制。
R.sulfidophilum，携带pBBR1-子Ptrc-MaSp1-（6聚体），在人造海水（ASW醍醐从人工海水）时由LED（730纳米，20至30瓦/米照亮培养2）与碳酸氢盐（1 g / l）作为无机碳源，而氮气（0.5 l / d）作为氮源。培养时间为7天（2a）。
图片编号2
选择最大的组成单元MaSp1-（6-mer）用于后续实验，因为较高的MaSp1分子量会导致蜘蛛丝纤维的较高拉伸强度。碳酸氢钠被用于提供无机碳因为碳酸氢盐具有更高的溶解度，比CO运输成本较低的2气体。
以前的研究人员已经进行了实验，以确定用于生长嗜硫菌的细胞所需的光照条件：强度（8和50 W / m 2）和波长（730、800和850 nm）。这项研究评估了重组R.sulfidophilum的生长效果ASW培养基中缺乏的几种其他营养素（酵母提取物，维生素，铁和磷）。
干细胞质量（CDM）从无酵母提取物时的0.90 g / L（含所有营养素）降至0.66 g / L，而在无磷时降至0.39 g / L。还已经确定，如果没有NaHCO 3，N 2气体或磷（2b； ASW + N 2，ASW + C + N 2，ASW + C + P和ASW + P），则重组R.sulfidophilum不能在ASW培养基中生长。+ N 2）。 这种ASW培养基变体中的CDM（〜0.4 g / L）最有可能源自接种物*
甚至用2％氯化钠洗涤样品后也可以接种。因此，碳，氮和磷的来源是在ASW培养基中生长重组硫杆菌的必要条件。
微生物接种剂* -含有对植物有用的微生物活培养物的生物产品。如预期的那样，细胞生长从0.34±0.02 g / L（ASW + C + N 2）显着增加到0.58±0.08 g / L（1.7倍）和0.81±0.02 g / L（2.4倍）分别存在酵母提取物（ASW + C + N 2 + YE）和磷（ASW + C + N 2 + P）的情况下。
通过添加酵母提取物和磷达到最高的CDM，得到1.04±0.06 g / L（增加了3.1倍）。
在ASW + N 2，ASW + C + N 2，ASW + C + P和ASW + P + N 2（2c和2d）。通过添加酵母提取物来辅助MaSp1蛋白的生产，这将使MaSp1蛋白的产量从0.12±0.10 mg / L（ASW + C + N 2）显着提高到3.93±2.76 mg / L（ASW + C + YE + N 2）。
酵母的添加也使MaSp1在总蛋白中的百分比从1.2±1.0增加到6.9±5.3％。有趣的是，磷的添加虽然对CDM的增加有正面影响，但对MaSp1蛋白的产生却具有负面影响。
相比ASW + C + YE + N 2在ASW + C + YE + P + N 2介质，所述的MASP1蛋白质的产量降低至2.71±1.09毫克/升，和MASP1中总蛋白的百分比降低至3.9±1.6％。
取决于培养基的蛋白质产量的这些差异的解释可能在于每种组分的功能性。例如，酵母提取物主要是促进蛋白质生物合成的氮源。同时，磷是许多重要细胞化合物中重要的宏量营养素和异质元素，可促进初级生产者的生长。
为了获得通常形式的蜘蛛丝，必须纯化MaSp1。
图像＃3
为了获得足够的MaSp1蛋白用于纤维挤出，进行了发酵（3a）以生产MaSp1-（6-mer）。
通常，蜘蛛蛋白的大小与抗张强度与指定的分子量呈正相关。大蛋白具有更多的链间和链内相互作用，更多的纠缠和更少的链端缺陷。
使用亲和色谱通过组氨酸标签（存在于MaSp1基因盒N端）进行亲和色谱纯化，并进行凝胶过滤色谱纯化。结果，从〜40g CWM获得〜10mg纯化的MaSp1-（6-mer）（3b）。
通过将溶解在六氟异丙醇（HFIP）中的10 wt％纯化的MaSp1-（6量）移入凝固浴中，然后用镊子手动牵拉来制备丝纤维（3c）。使用90％2-丙醇作为混凝浴可获得最佳结果，该混凝浴引起相对温和的脱水，从而可以有效地拉丝。扫描电子显微镜分析表明，纤维直径为10–20 µm，表面覆盖着平行于纤维轴的凹槽。断口扫描显示内部结构由微纤维（3d和3e）组成。
为了更详尽地了解这项研究的细微差别，建议您研究一下科学家的报告和其他材料。
结语
在这项工作中，科学家们谈到了成功创建用于生产MaSp1蛋白的微型工厂的问题。该产品的主要领导者是细菌R.sulfidophilum，这使它有可能在光合自养生长条件下实现人工蜘蛛网蛋白的光合营养表达。
换句话说，科学家已经对该细菌进行了基因改造，以产生蜘蛛丝，更具体地讲，蛋白MaSp1是其重要组成部分。除了遗传操作外，还必须为细菌培养建立最佳条件。事实证明，理想的环境是人造海水。另外，有必要使用氮气和酵母提取物作为营养源。这些成分一起导致有效的细菌生长，从而产生蜘蛛网蛋白。
同样重要的是，从蛋白质获得的蜘蛛网纤维的结构与Nephila物种的蜘蛛产生的天然纤维非常相似。
科学家指出，他们的蜘蛛丝蛋白生长方法也可以用于生长其他物质。将来，该研究的作者计划改善他们的微工厂，以增加蛋白质产量，并改善所得产品的分子特性。
据科学家称，他们的工作可以帮助解决许多问题：能源，水和粮食危机，固体废物问题，全球变暖等。之所以有如此广泛的可能性，是因为这样的工厂使用碳中和工艺生产可生物降解和生物相容的材料。
谢谢大家的关注，保持好奇心，祝您一周工作愉快。:)
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